Аналіз індукованих гамма-променями мутантів льону на молекулярно-генетичному рівні

Abstract

UA : Дана кваліфікаційна робота магістра обсягом 100 сторінки друкованого тексту містить 53 рисунка та 13 таблиць. Під час виконання роботи було опрацьовано 53 наукових джерела, з яких 45 є англомовними джерелами. Об’єктом дослідження були мутантні зразки льону М12, М23, М24, М80, отримані на базі сорту Ціан. В процесі виконання експериментальної частини цього дослідження застосовувалися такі методи: інструменти біоінформатики для обробки даних секвенування, виділення ДНК, спектрофотометрія, електрофорез ДНК, виділення ДНК з гелю, ПЛР, виділення РНК та ПЛР в реальному часі. У ході дослідження проведено біоінформатичну обробку даних секвенування геномів (Illumina sequencing) мутантних ліній льону М12, М23, М24, М80 та вихідного сорту Ціан. За допомогою інструментів порівняльної геноміки та програми IGV у відібраних генах біосинтезу флавоноїдів (FLS, UFGT, CROMT2, 3`GT, F3H та ін.) ідентифіковано низку гомозиготних мутацій (замін, інсерцій та делецій), що відрізняють мутантні генотипи від референсного геному. Для верифікації виявлених змін розроблено специфічні праймери та проведено ПЛР-аналіз. Аналіз експресії генів методом ПЛР у реальному часі (qPCR) показав, що різниця в експресії генів CHS та F3H є несуттєвою, тоді як для гену UFGT виявлено статистично значуще зниження експресії (t Stat = -6,4). На основі отриманих даних запропоновано молекулярні механізми формування мутантних фенотипів: втрата забарвлення пелюсток у ліній М12, М23 та М24 пов’язана з конкуренцією за субстрат через гіперактивацію гену FLS або порушенням стабілізації пігментів внаслідок інактивації UFGT. Встановлено, що хлоротичний фенотип лінії М80 зумовлений мутацією в гені CROMT2, що призводить до порушення антиоксидантної системи рослини.EN : This master's thesis, consisting of 100 pages of printed text, contains 53 figures and 13 tables. During the work, 53 scientific sources were studied, 45 of which are English-language sources. The object of the study was mutant samples of flax M12, M23, M24, M80, obtained on the basis of the Cyan variety. The following methods were used in the experimental part of this study: bioinformatics tools for sequencing data processing, DNA extraction, spectrophotometry, DNA electrophoresis, DNA extraction from gel, PCR, RNA extraction, and real-time PCR. During the study, bioinformatic processing of genome sequencing data (Illumina sequencing) of mutant flax lines M12, M23, M24, M80 and the original Cyan variety was performed. Using comparative genomics tools and the IGV programme, a number of homozygous mutations (substitutions, insertions and deletions) were identified in selected flavonoid biosynthesis genes (FLS, UFGT, CROMT2, 3`GT, F3H, etc.) a number of homozygous mutations (substitutions, insertions, and deletions) were identified that distinguish mutant genotypes from the reference genome. To verify the detected changes, specific primers were developed and PCR analysis was performed. Analysis of gene expression by real-time PCR (qPCR) showed that the difference in the expression of CHS and F3H genes is insignificant, while a statistically significant decrease in expression (t Stat = -6.4) was found for the UFGT gene. Based on the data obtained, molecular mechanisms of mutant phenotype formation have been proposed: loss of petal colour in lines M12, M23 and M24 is associated with competition for substrate due to hyperactivation of the FLS gene or disruption of pigment stabilisation due to UFGT inactivation. It has been established that the chlorotic phenotype of line M80 is caused by a mutation in the CROMT2 gene, which leads to a disruption of the plant's antioxidant system.